Egyetemi tanulmányait a Kolozsvári Protestáns Teológiai Intézetben végezte 1971–1975 között. Ezután 1984-ig Brassóban, majd Désen volt református segédlelkész. Az állami és egyházi hatóságokkal szembeni ellenállása, egyházi és kisebbségi természetű kritikai munkássága miatt törvénytelenül kizárták a lelkipásztorok köréből. 1984–1986 között 25 hónapig munkanélküli volt.

1986-ban Temesváron lett segédlelkész, majd rendes lelkész. 1988–89-ben az egyházi állapotokat és a romániai falurombolást bíráló megnyilatkozásaiért folyamatosan zaklatták. 1989-ben az állami és egyházi hatóságok pert indítottak ellene, megfosztották szószékétől, és a szilágysági Menyő községbe száműzték. Tőkés nem engedelmeskedett a felsőbb utasításnak, ellenállását a presbitérium támogatta. A hatalmi akarattal való szembeszegülés vezetett a temesvári népfelkeléshez.

1990-ben, a forradalom után rövid ideig a Nemzeti Megmentési Front Tanácsának tagja volt. A tagságról később lemondott, többek között a marosvásárhelyi fekete március következtében is.
Ugyanebben az évben megválasztották a Királyhágómelléki református egyházkerület püspökévé, valamint a Romániai Református Egyház Zsinatának társelnöke lett. 1990 februárjától 2003 januárjáig a Romániai Magyar Demokrata Szövetség (RMDSZ) tiszteletbeli elnöke volt; 1996-ban a Magyarok Világszövetsége tiszteletbeli elnökévé választották.

1999-ben kezdeményező alapítója a Partiumi Keresztény Egyetemnek, amelynek elnöki tisztét töltötte be, 2000-től az egyetemet fenntartó Por Universitate Partium Alapítvány (PUPA) elnöke mindmáig. 2003-tól az Erdélyi Magyar Nemzeti Tanács elnöke, 2004-től a Kárpát-medencei Magyar Autonómiatanács elnöke.

1990-ben az ideiglenes Nemzeti Megmentési Front tagja, 1990–2003 között az RMDSZ tiszteletbeli elnöke, 1990-től a Királyhágómelléki református egyházkerület püspöke, 1991-től a Partiumi Közlöny szerkesztőbizottságának elnöke, a romániai Református Egyház Zsinatának társelnöke; 1992-től az Európai Tiszteletbeli Szenátus tagja, a Magyarok Világszövetsége és a Magyar Reformátusok Világszövetsége elnökségi tagja volt. A Johannita Lovagrend tagja; 2004-től az Erdélyi Magyar Nemzeti Tanács elnöke, 2007-től az Európai Parlament képviselője.

2003-ban az RMDSZ szatmárnémeti kongresszusán a szövetség a tiszteletbeli elnöki tisztség eltörlése mellett döntött. Tőkes ezután megszervezte az Erdélyi Magyar Nemzeti Tanácsot (EMNT), amely a különböző autonómiaformák elérését tűzte ki céljául, és meghívta az RMDSZ-t mint a politikum képviselőjét, hogy a civil szervezetekkel és egyházakkal együtt vegyen részt a Nemzeti Tanács munkájában. Később a Kárpát-medencei Magyar Autonómia Tanács szervezésében, munkájában is részt vett.

2004-ben harmadik, és egyben utolsó püspöki mandátumát nyerte el, újabb hat évre. Az év őszén mint az EMNT elnöke közvetíteni próbált az RMDSZ és az erdélyi Magyar Polgári Párt között, a parlamenti választás előtti kiegyezés érdekében.

2007-ben a romániai EP-választások során a szavazatok 3,44%-át szerezte meg, ezzel bejutott az Európai Parlamentbe. Az Európai Néppárthoz való csatlakozását a szintén néppárti PD-L-es román és az RMDSZ-es képviselők azonban megakadályozták, így végül az Európai Zöldekkel együttműködő Európai Szabad Szövetség (EFA) nevű csoportba lépett be, és az Európai Zöldek – Európai Szabad Szövetség frakció tagja lett.

2008-ban szintén megpróbált közvetíteni a Magyar Polgári Szövetség mellett közben megalakult Magyar Polgári Párt és az RMDSZ között, hogy a magyarságnak egységes, erős képviselete lehessen a román parlamentben, ismét sikertelenül.

A 2009-es romániai EP-választásokon megint mandátumot szerzett, ezúttal mint az EMNT és az RMDSZ közös jelöltje. Ezután az Európai Néppárt frakciójának tagja lett. 2010 júniusában az EP-alelnöki posztjáról leköszönő Schmitt Pál utódjául jelölte a Fidesz, majd az Európai Néppárt frakciója meg is választotta.

2010 októberében egy új romániai magyar párt megalapításának ötletét vetette fel. Az Erdélyi Magyar Néppárt (EMNP) 2012 februárjában tartotta első küldöttgyűlését, ahol Toró T. Tibort választották meg elnöknek.
Tőkés László nevét viseli a Tőkés László Alapítvány, amely a Tőkés László-díjat ítéli oda.